Хитозан и его свойства как основы экологически безопасных средств защиты растений.

из материалов монографии С.Л. Тютерева "Научные основы индуцированной болезнеустойчивости растений" (Санкт-Петербург, 2002г., РАСХН ВНИИЗР)

Источник получения хитозана - хитин широко распространен в природе и занимает среди биополимеров второе по значению место после целлюлозы (ежегодно на планете образуется свыше миллиарда тонн хитина), в частности, он является структурным материалом экзоскелета членистоногих (насекомых, ракообразных и др.), моллюсков и ряда морских организмов, нематод, содержится во многих грибах. Впервые хитин был получен французским профессором Брэкон-нотом в 1811 г. Он обрабатывал шампиньоны и другие высшие грибы разведенным раствором щелочи и выделил полимер, содержащий в отличие от целлюлозы азот и названный им «фун-гином», В 1823 г. аналогичное соединение было выделено из насекомых французским ученым Одиером и названо «хитином» (от греческого слова хитон — оболочка). Это исследование впервые установило связь между структурой кутикулы насекомых и клеточной стенки грибов.
Хитозан был открыт Роуджетом в 1859 г. (Rouget, 1859). Он установил, что при кипячении в концентрированном растворе КОН хитин становится растворимым в органических кислотах и назвал полученное соединение «модифицированным хитином». Название «хитозан» было дано модифицированному хитину Хоппе-Зейлером в 1894 г. Однако изучение структуры хитина и хитозана продвигалось крайне медленно. Ряд ошибок в определении структуры был связан с тем, что хитин для исследования получали из различных природных источников, а также с тем, что образцы хитина не были полностью очищены от белков. В течение первой половины XX века исследования по хитину были направлены в основном на определение его присутствия в различных живых организмах (Schmiedeberg, 1920), в процессе которых была установлена идентичность хитина из грибов и панциря крабов (Ramrnelberg, 1931), а также обнаружено разделение грибов на содержащие хитин и содержащие целлюлозу в клеточных стенках (Frey, 1950). Были начаты исследования по возможности практического использования хитина (Никольский, 1936).
Основная информация по химической и физической структуре хитина и хитозана из различных источников, ферментам, участвующим в их метаболизме в живых организмах, и возможности практического использования этих полимеров была получена во второй половине XX века (Jeuniaux, 1963, 1971; Bri-macombe, Webber, 1964; ВеМШег, 1965; Goodwin, Mercer, 1972; Brimacombe, 1973; Glaser, 1973; Preston, 1974; Muzzarelli, 1977; Chitin, Chitosan and Related Enzymes, 1984; Chitin and Chitosan, 1989; Chitin, Chitosan and their Novel Applications, 1992; Chitin chemistry, 1992; Yalpani et al, 1992; Chitin and Chitosan. Envi-romental Friendly and Versatile Biomaterials, 1996; Chitin handbook, 1997; Advances in chitin science, 1998; Chitin and Chitinases, 1999). Среди перечисленных монографий и сборников особое значение имела работа итальянского профессора Рикардо Муза-релли (Muzzarelli, 1977), так как она появилась в период, когда пришло понимание того, что хитин и хитозан, ферменты, участвующие в их синтезе и гидролизе, играют фундаментальную роль в росте, дифференцировке, питании многих видов живых организмов. В этот же период возрос интерес к хитину как коммерческому продукту, так как накопилось большое количество работ и патентов по возможности его использования для очистки сточных вод, в медицине, косметике, производстве некоторых пищевых продуктов. Рикардо Музарелли возглавил Первую Международную Конференцию по хитину и хитозану, проведенную в апреле 1977 г. За прошедшие 25 лет интерес к хитину и хитозану значительно вырос в связи с возможностью их применения в области химической технологии, медицины, биотехнологии, пищевой и оборонной промышленности, сельскохозяйственного кормопроизводства, очистки сточных вод и др. Исследуются химические свойства хитозана, разрабатываются мягкие способы его получения из хитина как химическим, так и биотехнологическим путем — с помощью микроорганизмов и ферментов. Производство хитина и хитозана стало отраслью промышленности ряда индустриально развитых стран. Этому способствовало то, что сырьё для их получения постоянно возобновляется и практически не ограничено. Ежегодно в биоцикле только Средиземного моря образуется около 2,3 миллионов тонн хитина. Богатые природные ресурсы хитина используются в весьма небольшой сте-пеци. По данным ФАО, производство хитина из морского сырья составляет около 36,7 тысяч тонн в год, в производстве хитозана из хитина лидируют Япония и США, получающие в год 700 и 500 тонн хитозана соответственно. В России основным источником для получения хитина и хитозана являются панцири морских животных: дальневосточных крабов (камчатского краба и краба-стригуна) и антарктической креветки (криля), имеющиеся в больших количествах; при этом именно из панцирей дальневосточных крабов можно получить наиболее ценные хитин и хитозан лучшего качества. В последние годы из панцирьсодержащих отходов переработки крабов налаживается промышленное производство хитина и хитозана (хитин и хитозан из дальневосточных крабов пользуются наибольшим спросом на мировом рынке, при прогнозируемом уровне вылова крабов в 70 тысяч тонн в год можно получить в год около 3 тысяч тонн хитина).
Наш интерес к хитозану как специалистов, занимающихся проблемами защиты растений, имеет под собой прочную основу. Уникальность молекулы, экологичность соединения, возможность получения из хитина низкомолекулярных биологически активных веществ привлекли наше внимание к хитозану ещё 15 лет назад. Эти соединения считаются полимерами XXI века (Chitin and Chitosan Handbook, 1995).
Молекулы хитозана имеют положительно заряженные активные реакционоспособные аминогруппы, относительное содержание которых зависит от степени деацетилирования. Особый интерес представляет использование хитозана в сельском хозяйстве в связи с тем, что он является биологически активным веществом, оказывающим действие на клетки растений, бактерий. Хитозан совершенно безопасен для человека, сельскохозяйственных животных и окружающей среды, в природных условиях он распадается на полностью безопасный простой сахар. глюкозамин и далее до СОз и Н2О. Применение хитозана во всех сферах хозяйственной деятельности как экологически чистого вещества разрешено, к примеру, в США Агенством по охране окружающей среды еще в 1988 году (Fed. Registn, 1988).
Несмотря на некоторую биоцидность хитозана против фито-патогенов, он в чистом виде в защите растений практически не используется. Это связано с тем, что изучалось в основном прямое действие хитозана на возбудителей болезней и эффективность этого действия была низкой. Препараты хитозана с антибактериальным действием (Ito et ai, 1993) и препараты для защиты морских водорослей от болезней (Takechi, Manaki, 1989) имели очень низкое значение рН (в последнем случае рН = 2-3) за счет высокого содержания кислот, что вероятно и обеспечивало биоцидный эффект этих препаратов. Прямое фукгицидное действие хитозана против фитопатогенных грибов является слабым в сравнении с фунгицидами (Yamazaki, 1993; Toyoda et al, 1993, Yokoyama, Muraoka, 1994). Так, по крайней мере, считалось, когда мы только начинали свои работы в этом направлении. В настоящее время среди различных хитозанов найдены такие, которые обладают и прямым биоцидным действием на фитопатогены при рН 4-5, хотя оно уступает биоцидному действию фунгицидов.
Так как хитозан относится к классу аминов, являющихся слабыми основаниями, он легко образует соли с анионами. Многие из таких солей водорастворимы. В кислой среде хитозан состоит из электронейтральных глюкозаминных звеньев и звеньев3 в которых глюкозамин протонирован и ассоциирован с анионами соответствующей кислоты. Соотношение ассоциированных и не-протонированных звеньев в полимерной цепи хитозана зависит от рН среды. Такая система обычно называется солью хитозана (хитозония), но в этой системе могут присутствовать и свободные аминогруппы.
Нами были исследованы механизмы действия хитозана на растения с позиций возможности использования его в качестве экологически безопасного химического индуктора болезнеустойчивости, то есть вещества, повышающего устойчивость через активацию генов защиты и измененный обмен веществ растительной ткани. С этой целью были получены разные препаративные формы различных видов хитозана отечественного производства, приготовлены его композиции с нефитотоксичными органическими кислотами и другими сигнальными молекулами болезнеустойчивости, проведена оценка их биологической эффективности. Полученные результаты дают представление о методических основах применения хитозана в защите растений и растениеводстве. Ниже приведены некоторые результаты и обсуждаются механизмы действия хитозана, а также даны некоторые практические рекомендации по применению препаратов на основе этого биополимера.
Анализ патентной информации по хитозану применительно к решению проблемы защиты растений показал, что хитозан не получил широкого применения в защите растений в связи со слабой активностью при прямом действии на фитопатогенные организмы. Создать высокоэффективные биоцидные препараты на основе хитозана против фитопатогенов невозможно, они неконкурентоспособны по биоцидности с имеющимися средствами защиты растений. В настоящий момент в США, Японии и странах Европы нет эффективного биоцидного препарата на основе хитозана, который был бы конкурентоспособен по сравнению с фунгицидами. Мы разработали принципиально новую концепцию создания препаратов на основе хитозана для применения в защите растений, заключающуюся в использовании его как индук-
неспецифической устойчивости растений к болезням в сочетании с сигнальными молекулами болезнеустойчивости. При этом, в отличие от фунгицидов, хитозан применяется как химический стимулятор (активатор), что определяет другую стратегию и тактику его применения - in vivo, а не in vitro. Это приводит к общему повышению болезнеустойчивости растений, снижению вредоносности болезней и повышению за счет этого урожая и качества продукции. Показано, что в качестве средства защиты растений хитозан действует не прямо на патоген, а через измененный обмен веществ защищаемого растения (Tiuterev et ai., 1996).